Der entscheidende Schritt der STED-Mikroskopie beruht nicht auf Licht, sondern auf Dunkelheit. Denn das Abbesche Gesetz der Abbildungsgrenze hat nach wie vor Gültigkeit: Bringt man die gesamte Probenoberfläche zum Leuchten und betrachtet sie unter dem Mikroskop, sieht man keine Strukturen kleiner als 200 Nanometer - egal wie findig das Linsensystem konstruiert sein mag.
Für Hell ist das der eigentliche Trick des Verfahrens: "Je mehr man die Sättigungsschwelle überschreitet, desto kleiner wird der Fluoreszenzfleck und umso besser kann man auflösen." Überschreitet man die Abschaltschwelle der Fluoreszenzmoleküle beispielsweise um das Neunfache, so verdreifacht sich die Auflösung in etwa. Überschreitet man sie um das Hundertfache, ist der Auflösungsgewinn rund verzehnfacht. Man braucht dazu jedoch Fluoreszenzmoleküle, die eine möglichst niedrige Abregungsschwelle haben. Denn eine zu hohe Intensität des STED-Pulses würde die Moleküle zerstören.
Jeder Punkt auf der Probe lässt sich dank der neuen Methode mit einer Auflösung deutlich unter derjenigen konventioneller Lichtmikroskope abbilden. Winzige leuchtende Bereiche, die kleiner als die Abbildungsgrenze sind, bleiben in einem Meer aus Dunkelheit übrig. Ist ein Fleck untersucht, nimmt man sich einfach den nächsten vor. Aus den einzeln aufgenommenen Lichtflecken kann ein Computer dann ein Bild der gesamten untersuchten Probe zusammensetzen.
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